高中生物学难点：PCR技术
“pcr技术”是高中生物教材选修本中的教学内容，是dna分子体外扩增的的重要应用，考纲只要求学生初步了解，教材也只对这部分知识进行简单的介绍。但因为这部分知识的微观性和抽象性，在教学过程中学生对pcr技术过程中的一些问题感到难以理解，并由此提出了许多问题。现将这些问题归纳、分析如下。
pcr技术全称聚合酶链式反应，是一种分子生物学技术，现已被广泛运用于临床和实验室，用于扩增特定的dna片段。其基本原理就是在体外摹拟细胞内dna复制的相关条件，最终完成特定基因的体外复制。pcr技术由变性、退火、延伸三个基本步骤完成。
变性的目的是使模板dna双链解旋成为单链以便与引物结合，通常加温至95℃（这是taq酶进行30个左右循环而活力不致受到过多损失时能耐受的最高温度）。模板的完全变性对pcr成功与否至关重要，第一轮循环中变性时间往往为10min，然而根据经验，在其余各次的循环中一般95℃ 30s足以使各种模板完全变性。可能的情况下可缩短该步骤时间，因为变性时间过长会损害酶活性。当模板的g+c含量超过55%时，需要更高的变性温度，可选用来源于古细菌的dna聚合酶，因为它比taq酶更能耐受高温。
模板变性成单链后，温度快速降至退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列可发生结合。退火温度的选择至关重要，如果退火温度太高，引物不能与模板很好地结合，扩增效率将会非常低；如果退火温度太低，引物将产生非特异性结合，从而导致非特异性DNA片段的扩增。退火时间一般为30-60s，足以使引物与模板之间完全结合。
模板–引物结合物在Taq酶的作用下，沿着5’→3’的方向合成一条与模板DNA链互补的链。延伸时的温度常为72℃（Taq酶的最适温度为72℃-78℃）。在最适温度下，Taq酶的聚合速率约为2000bp/min。但作为一个由经验确定的规则是，靶基因的每1000bp的扩增产物的延伸时间被设计为1min。另外，延伸时间随扩增片段长短而定，甚至在所扩增目的基因的长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略。
重复循环“变性→退火→延伸”过程就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。在最后一个循环后，反应在72℃维持5-10min，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
问题2 在PCR技术操作中，是否需要能量，需向溶液中加ATP吗？
DNA分子在PCR仪中扩增与在细胞内复制相似，也需要原料、能量、酶、引物、适宜的温度和pH等，但PCR技术操作中不需要单独提供ATP作为供能物质。在PCR技术中，DNA复制的解旋断裂氢键的能量来自PCR仪的加热，高温达90℃~95℃时DNA分子双链即打开，dNTP的连接能量来源于Taq酶聚合基本单位dNTP加入到延伸链的3\\\\\\\\’端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这两个反应互相偶联，推动Taq酶聚合单体延伸DNA分子。
问题3 PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么作用？引物会在PCR仪中复制吗？
引物是在DNA分子复制时起引导作用一段短RNA或单链DNA片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。细胞内的引物是RNA链，由RNA酶根据DNA链碱基序列自动合成。
在PCR技术中，引物是人工合成的两段寡核苷酸链序列，是单链DNA片段。由于DNA聚合酶的特异性和DNA分子两条链的两端的差异性，决定了DNA分子体外扩增时必需设计两种引物，分别与DNA分子两条模板链的两端的感兴趣区域互补，以利于DNA聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引导作用。对于一段需扩增的DNA的核苷酸序列，引物可根据这一序列经计算机设计并合成，使其能有效地扩增模板DNA序列，引物设计的优劣直接关系到PCR技术扩增DNA的成功与否。引物不会在PCR仪中复制，引物是设计并配比好后加入PCR仪溶液中的。体外人工设计的引物广泛用于DNA聚合酶链反应（PCR技术）、测序和探针合成等。
尽管有很多因素可影响PCR扩增反应的效率与特异性，但最关键的因素要数引物的设计。引物设计的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列退火形成稳定的结构时才能达到这个目的。
①引物的长度一般在18~25bp，太短则特异性不够强；太长则退火温度会比较高。
②引物G+C含量以40%-60%为宜，太少扩增效果不佳；过多则易出现非特异条带。4种碱基最好随机分布。
③两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链而得不到目的基因片段。
④一条引物自身不能有大于4bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的退火。
⑤两条引物的退火温度相差不能大于5℃。如果相差太大，操作时一般选择较低的那个退火温度，那么另一条引物的非特异性结合就会增加。
⑥引物3\\\\\\\\’端的性质非常关键，如果可能的话，最末及倒数第二个碱基的最佳选择是G和C。
⑦实际应用中最重要的一点，设计的引物在合成之前，有必要在DNA数据库中进行BLAST检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。
问题5 为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？PCR的引物是DNA？
细胞内DNA分子复制过程可概括为：（1）双链的解开；（2）RNA引物的合成；（3）DNA链的延伸；（4）切除RNA引物，填补缺口并连接相邻的DNA片段。迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所发现的DNA聚合酶，都必须有模板链和3\\\\\\\\’-OH末端的引物链存在，才能合成新的DNA链（由5’→3’方向延伸）。这就需要在DNA复制起始阶段由RNA聚合酶首先合成一小段RNA为引物，RNA引物就提供了这个羟基，DNA聚合酶Ⅲ才会真正开始DNA链的合成。
在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，合成的RNA与模板链结合，从而引导DNA分子子链的延伸。而DNA聚合酶由于它的保真系统决定它不能从头合成DNA单链，所以DNA复制时先由RNA聚合酶合成一段RNA链，再由DNA聚合酶起到DNA分子复制时的延伸功能，形成互补的子链。
再从DNA分子复制的忠实性看，一般DNA分子两端的碱基对不稳定，因此在合成起始段时，开头的几个碱基如果发生差错将不易校正。为了保证产生高保真的DNA分子就得先延长一个要丢弃的引物，使新加上的碱基严格按照碱基互补配对和上下文的联系，以保证复制的忠实性，即中途配对有差错也会通过酶自动修复。另外，使用RNA作为合成DNA的引物，主要在于它易被DNA聚合酶III作为DNA合成终止的信号所识别，使DNA聚合酶Ⅰ进行切口移位，以减少DNA复制的出错率。如果用DNA单链作为引物，则不能被DNA聚合酶Ⅲ识别，因为DNA、RNA的化学组成不同，从而影响了DNA分子的复制。这有可能是DNA分子复制以RNA为引物的主要原因。
在PCR仪中用的是DNA引物，是人工设计合成，一般不用RNA作为引物，因为RNA引物需要被切除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA引物被切除后将使这个新合成的DNA的两端都出现了一段单链而不稳定。
退火温度为引物和模板结合时候的温度参数，它是影响PCR特异性的重要因素。退火温度的高低需要多方面考虑，主要取决于引物的长度、碱基组成等，一般以引物的Tm值（引物与其模板链形成的杂合分子的解链温度）为参考，计算公式为:Tm/℃=4（G+C）+2（A+T）。
由公式可以看出，当引物长度一样时，G+C碱基含量高的引物退火温度高。理想状态下退火温度应控制在既能保证引物的有效退火，又能减少非特异性结合。G-C碱基对之间的氢键比A-T碱基对的氢键多，为了确保G+C含量高的引物错配后能够有效从模板链上脱落下来从而减少非特异性扩增，其应该选择的退火温度就相应高一些。
有时为了避免对每对引物进行最佳退火温度的优化与测定，常采用降落PCR。降落PCR的起始温度高于计算的Tm 15℃左右，在接下来的循环中，每一个循环退火温度降低1℃，直到达到一个较低的退火温度（低于Tm 5℃），该温度称为“touchdown PCR”退火温度。
然后在该温度下继续10个左右循环。该策略的目的在于确保第一个引物–模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异性扩增，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物已经有几何级数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。
问题7 高中生物学教材中提及的PCR技术有哪些应用？
从PCR扩增过程来看，在最初的两个循环中，从一条引物开始的DNA链延伸往往要超越与另一条引物互补的序列；从第三个循环开始出现第一个与两条引物之间的长度相同的DNA分子；接下来的循环，与两条引物之间的长度相等的DNA片段（含目的基因）将以几何级数方式被扩增与积累。所以，只需了解目的基因的上下游序列以便设计引物对，使目的基因处于两条引物之间，即可通过PCR技术以少量生物DNA为模板获取大量目的基因，而没必要知道目的基因的全部序列。
7.2在基因水平上利用PCR技术对蛋白质进行定点诱变改造
基因突变技术是蛋白质工程中的重要技术之一，可以有目的地改变DNA序列中的碱基，从而改造天然蛋白质，使之更符合人类需求。
任何基因，只要目的基因两端及需要变异部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造基因的序列。在需要诱变的位置合成两条带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与目的基因上下游的两条引物作PCR，这样得到的两个产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物。该方法简便易行，准确高效，已成为最常用的定位诱变方法。
自PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得的是极微量的组织也可经PCR扩增而进行各种检测，为疾病诊断提供新的手段。
1.沈静丹. 浅谈PCR技术[J]. 生物学教学,,39(02):58-59.
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